一、概述
1、高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography \ HPLC)又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。该方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术应用。
2、什么是色谱
色谱法的简称(又叫色层法,层析法),其本质是一种分离分析方法
常见的分离方法:蒸馏,离心,电泳,过滤,超滤。
目前最有效的分离方法:色谱
3、色谱法(Chromatography)溯源100多年前俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用的实验方法他将植物色素的石油醚提取液倒入装有碳酸钙的直立玻璃管,再加入石油醚使其自由流下,结果色素中各组份互相分离形成各种不同颜色的谱带Tswett用希腊语chroma(色)和graphos(谱)描述他的实验方法,即现在的Chromatography(色谱法)1906年正式命名(见诸文献)20世纪30年代开始广泛研究和应用高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
二、HPLC原理
1、正相色谱(normal phase)n流动相极性小于固定相极性的分配色谱法称为正相分配色谱。常用的分析柱有:n氨基柱、氰基柱、硅胶柱。n常用流动相为极性小的有机溶剂。2、反相色谱(reversed phase)n流动相极性大于固定相极性的分配色谱法称为反相分配色谱法。常用的分析柱有:ODS( C18),C8,C2。n常用流动相为甲醇-水,乙腈-水。
3、空间排斥色谱(stericexclusion)n也称凝胶色谱,依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离,类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内,分子越大,保留时间越短。凝胶渗透——以有机溶剂为流动相凝胶过滤——以水溶液为流动相对于相同化学组成的高分子化合物,其分子尺寸大小与分子量成正比,因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。
二、HPLC色谱系统
高效相色谱流程图
流动相类别
按流动相组成分:单组分和多组分按极性分:极性、弱极性、非极性按使用方式分:等度洗脱和梯度洗脱
水
配制流动相应用新鲜水,水质要求越高放置时间越短。理想的HPLC用水应为0.055 μS/cm的超纯水,并通过0.22 μ m的滤膜,除去热源、有机物、无机离子及空气等。
溶剂
色谱纯(甲醇,乙腈,乙醇,丙酮,异丙醇)
试剂 分析纯
1)泵中气泡使液流波动,改变保留时间和峰面积
2)柱中气泡使流动相绕流,峰变形
3)检测器中的气泡产生基线波动
流动相的保存
室温下密封,避光保存
当日现配现用:低温下密封保存,一般不超过5天,防止 微生物生长
低温密封保存防止有机相的挥发
氨基柱
C18柱(反相色谱柱)
水溶性凝胶色谱柱
三、高效液相色谱法的实验流程
(1)准备流动相,配制好sealwash 和ndwash的溶液,并进行脱气处理
(2)开机前要检测各部件连接是否完好,然后打开HPLC的各个部件的电源,等待HPLC自检通过,用上述溶液清洗
(3)对泵进行dryprime、wetprime操作,排出管路中的气体,让流动相充满管路
(4)安装相应的色谱柱,用合适的条件对系统进行平衡
四、仪器保养与维护
色谱柱的保养
HPLC部件的维护
HPLC的泵的保养:使用流动相尽量要清洁;进液处的砂芯过滤头要经常清洗;流动相交换时要防止沉淀;避免泵内堵塞或有气泡;每次分析结束后,要反复冲洗进样口,防止样品的交叉污染
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