土壤脲酶是作用于线型酰胺的C—N键(非肽)的水解酶,一般脲酶含量和微生物有机质等呈正相关,能酶促土中尿素水解成氨,故也在一定程度上代表氮含量的状况。今天就和大家分享一下如何通过靛酚蓝比色法对土壤脲酶进行测定。
一、实验试剂
1.10%尿素:称取10g尿素,用蒸馏水溶至100ml。
2.柠檬酸盐缓冲液(PH=6.7):184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并,用1mol/LNaOH将PH调至6.7,用水稀释至1000毫升。
3.苯酚钠溶液(1.35mol/L):62.5克苯酚溶于少量无水乙醇,加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮,用无水乙醇稀释至100毫升(A),存于冰箱中;27克NaOH溶于100毫升水(B)。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合,用蒸馏水稀释至100毫升。
4.次氯酸钠溶液:用水稀释试剂至活性氯的浓度为0.9%,溶液稳定。(9ml—100ml中)
5.氮的标准溶液(0.1mg/ml):精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml,得到1ml含有0.1mg氮的标准液。
6.甲苯
二、主要仪器
万分之一分析天平、恒温摇床、分光光度计、温度计
三、试样的制备
取风干的实验室待测样品充分混匀后,按四分法缩减至100g,粉碎,然后全部通过18目孔径筛,装入样品袋备用。
四、实验过程
4.1.标准曲线的测定
吸取10ml氮的标准溶液定容至100ml,摇匀。从其中分别吸取0,1.00,3.00,5.00,7.00, 10.00ml移至50ml比色管中,加水至20ml,再加入4ml苯酚钠的溶液,充分混合。紧接着加入3ml次氯酸钠,随加随摇匀,放置20分钟,用水稀释至刻度。将显色液在可见分光光度计上于578nm处,进行比色测定,以试剂空白为参比。以标准溶液氮含量为纵坐标,以吸光度值为横坐标绘制标准曲线。
4.2.土样中脲酶活性的测定
分别称取2-5g风干土样于50ml离心管中,向其中加入1ml甲苯,以使土样全部湿润为宜。放置15分钟后,加入10ml 10%尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液(pH=6.7),并摇匀。将锥形瓶放入37℃恒温箱中,培养24h。培养结束后,用热至38℃水稀释至刻度,充分摇荡,离心,过滤。分别吸取(1-3ml)滤液于50ml比色管中,加蒸馏水至20ml,充分震荡,然后加入4ml苯酚钠,充分混合,再加入3ml次氯酸钠充分摇荡,放置20分钟,用水稀释至刻度,溶液呈现靛酚的蓝色(在1h内保持稳定)。于578nm处进行比色测定。
4.3.无土对照
不加土样,其他与实验同,以检验试剂忖度,整个实验设1个。
4.4.无基质对照
以等体积水代替基质,其他与实验相同。 土壤脲酶活性以24小时1g土壤中NH3-N的毫克数表示。
五、结果计算:
以24小时后1g土壤中NH3-N的毫克数表示土壤脲酶活性(Ure)。
Ure=(a样品-a无土-a无基质)×V×n/m
式中:
a样品为样品吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;
a无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;
a无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的NH3-N毫克数;
V为显色液体积;
n为分取倍数,浸出液体积/吸取滤液体积;
m表示烘干土重
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